Micología

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The prophylactic and empirical use of antifungal agents in general, and azoles and echinocandins in particular, has contributed to the emergence of strains with elevated MICs (microbiological resistance), whose clinical impact and relevance are increasingly concerning. Moreover, therapeutic failure or clinical resistance is frequently observed even in the absence of microbiological resistance.
One of the factors that may explain clinical resistance in the absence of microbiological resistance is inadequate drug exposure at the site of infection, together with the pathogen’s adaptive response to host defences or to the administered antifungal therapy.
This research line, active since 2010, aims to advance the understanding of clinical resistance in Aspergillus fumigatus infection through the study of antifungal dose–response relationships by evaluating PK/PD parameters and their role in treatment efficacy. In addition, it investigates the role of biofilms as adaptive strategies that enhance fungal resistance to antifungal agents and to host immune cells.

Exposure: Pharmacokinetics of Antifungal Agents
There is now substantial evidence that the administration of an effective antifungal agent at the appropriate dose is essential to achieve adequate drug concentrations at the site of infection. Through the development of this research line (active since 2009), our group has gained extensive expertise in the development and application of chromatographic methods (HPLC/UPLC–UV/fluorescence) for antifungal quantification, which are useful for therapeutic drug monitoring (TDM).

Techniques that allow monitoring of blood drug concentrations constitute essential tools in patient management, enabling dose optimization by determining whether drug exposure is inadequate—potentially contributing to therapeutic failure and the emergence of resistance—or, conversely, excessive, thereby increasing the risk of significant toxicity.

In addition, the application of disciplines such as pharmacogenetics to antifungal therapy is promoting personalized treatment approaches and improving the management of severe invasive fungal infections (IFIs).
The use of alternative animal models, with ethical approval and under regulatory frameworks, together with methodological advances, has facilitated the preliminary study of dose–response relationships for both established antifungal agents and newly developed compounds.

Response: Monitoring Treatment Efficacy
An aspect of major relevance in the management of severe invasive fungal infections (IFIs) is the evaluation of the efficacy of the administered therapy. This research line further explores the characterization of circulating fungal-specific biomarkers that may help distinguish infection from fungal colonization and assess the effectiveness of the established treatment.
Within this framework, our efforts have focused on the study and characterization of compounds related to fungal secondary metabolism, such as gliotoxin and its derivative bis(methylthio)gliotoxin, detected in tissue and blood samples from patients with aspergillosis and in animal models, as well as other metabolites associated with fungal virulence (e.g., fumagillin and pseurotin A).

More recently, this research line has expanded to investigate adaptive strategies such as the formation of complex biofilm structures—often multispecies in nature and involving intricate interaction mechanisms—which may explain fungal resistance to antifungal agents and host immune cells, thereby contributing to therapeutic failure (clinical resistance).

Resistance mechanisms of Aspergillus fumigatus to antifungals

Aspergillus fumigatus is a universally distributed opportunistic fungal pathogen with a significant global incidence and extremely high mortality. The widespread and extensive use of azole antifungals has led to the emergence of A. fumigatus azole resistant, resulting in serious consequences for patients infected with these isolates, who are left with limited therapeutic options.       
Initially, the emergence of resistant strains was very sporadic and showed point mutations in key areas of the Cyp51A enzyme (G54, G138, F219, M220, G448S) in strains isolated from patients undergoing long-term treatment with azoles. This clinical pathway is due to the selective pressure that azoles exert on A. fumigatus within the patient. However, since 2014, resistance has grown significantly, and almost all azole-resistant A. fumigatus strains have a combined mechanism of modifications in the promoter and the coding portion of cyp51A (TR34/L98H or TR46/Y121F/T289A). Both resistance mechanisms are frequently detected in strains from patients who have never been exposed to antifungal therapy. In these cases, the involvement of an environmental route is raised, in which the unintentional exposure of A. fumigatus to DMIs (imidazole and triazole) in the field would be favoring the resistance emergence.

Origin and Evolution of A. fumigatus Resistance to Antifungals

Nowadays, the isolation of A. fumigatus strains resistant to antifungals is an increasing global emergence. The continuous exposure of A. fumigatus to environmental fungicides, used for crop protection against other fungal species that cause agricultural damage, is believed to be selecting multi drug resistant strains. The main azole resistance mechanisms in A. fumigatus are strains with modifications of the azole target (cyp51A gene), mainly the TR34/L98H, followed by TR46/Y121F/A289T. Both types of mechanisms are responsible for panazole resistance and cross resistance to DMIs used for crop protection (imidazoles and triazoles). More recently, resistance to several fungicide classes such as, Bencimidazoles (MBC), Estrobilurinas (QoIs), sucinato deshidrogenase inhibitors (SDHIs) and  Dicarboximides, has also been acknowledged.

Genomic characterization (NGS) of strains from both clinical and environmental sources allows linking genomic differences with the acquisition of resistance to different fungicides. Adding data on susceptibility to non-azole antifungals provides a more precise picture of the phylogenetic relationships among strains, as distinct subclades are formed in which strains multi-resistant to non-azole antifungals grouped with azole-resistant strains with TRs resistance mechanisms. This formation of specific clades with strains that differ in geographic origin and year of isolation suggests the existence of a common link, an evolutionary origin according to which the strains have developed under similar circumstances that converge in a series of multi-resistance mechanisms to fungicides from different families. The resistance of A. fumigatus to non-azole fungicides, that are exclusively used in the environment, confirms that the strains with TRs resistance mechanisms are selected and developed in the environment where they are exposed to the selective pressure of multiple fungicides.

Tolerance and Persistence to Azole Antifungals in Aspergillus fumigatus

Tolerance and persistence are two phenomena by which pathogenic organisms can survive the microbicidal action of antimicrobials that should kill them over an extended period. In our laboratory, we investigate the ability of certain A. fumigatus isolates to exhibit tolerance and persistence to azoles, which are the first-line antifungal treatment for aspergillosis infections.

We are developing methodologies to detect and study tolerance and persistence, both in the laboratory and in clinical diagnosis. Using these methods, we are exploring the underlying molecular and genomic mechanisms that enable these phenomena. In addition, we are investigating the potential relevance of tolerance and persistence in the efficacy of antifungal treatment.

Differential Modulation of Persulfidation in the Fungus and Host as a Novel Antifungal Strategy

Persulfidation is a post-translational modification in which an activated sulfur group (S₂-), through the action of an enzyme, performs a specific nucleophilic attack on thiol (-SH) groups of cysteine residues in target proteins, forming a persulfide group (-SSH). This modification has been shown to modulate the intrinsic activity of proteins, playing a crucial role in various cellular mechanisms and physiological functions.

In our previous research, we demonstrated that correct levels of persulfidation are important both for A. fumigatus virulence and for orchestrating an adequate immune response in the host. Based on this, our research explores the hypothesis that differential modulation of persulfidation could constitute a novel antifungal treatment strategy.

We are investigating the ability of compounds to inhibit fungal enzymes responsible for persulfidation, aiming to reduce persulfidation levels and thereby decrease A. fumigatus virulence. Additionally, we are studying the use of sulfur donors as a potential means to enhance persulfidation in pulmonary host cells, with the goal of strengthening the immune response.

Evolution of Cross-Resistance to the New Antifungals Olorofim and Manogepix

Azole resistance is already present worldwide. Studies have shown that the most common resistance mechanisms—tandem repeats in the promoter of the gene encoding the azole target—have developed in agricultural settings due to the indiscriminate use of pesticides from the same family as clinical azoles.

Currently, two new clinical antifungals with novel molecular mechanisms of action have been introduced: olorofim and manogepix. However, analogous compounds with the same mechanism of action, ipflufenoquin and aminopyrifen, have also been developed for use as pesticides. This situation puts us at risk of repeating the same mistake made with azoles.

In this international collaborative project, we study the evolution of resistance and cross-resistance to these clinical and environmental antifungals. Our goal is to design strategies to minimize the emergence of resistance in the environment and develop early detection methods for antifungal resistance.

Susceptibilidad del huésped a las infecciones fúngicas invasoras

Se estima que más de un millón y medio de personas mueren al año en el mundo debido a una enfermedad fúngica invasora (EFI). Los tratamientos con inmunosupresores, terapias con corticoides, trasplantes de células hematopoyéticas y órgano sólido así como tratamientos quimioterapéuticos contra el cáncer han favorecido el aumento de estas infecciones fúngicas. El género Aspergillus es la principal causa de EFI por hongos filamentosos, siendo A. fumigatus la especie principalmente aislada en la mayoría de los casos y más frecuentemente asociada a Aspergilosis Invasora. 
Muchas de estas infecciones están infra-diagnosticadas debido, tanto a la falta de sospecha clínica como a las limitaciones diagnósticas. Esta línea de investigación tiene como principal objetivo mejorar el pronóstico de la infecciones en pacientes con riesgo de desarrollar infecciones invasoras por hongos. Para ello se estudian marcadores del individuo (denominados biomarcadores del hospedador) que puedan ser detectados de forme temprana en muestras de pacientes en riesgo y que nos permita estratificar a los mismos en función de la susceptibilidad a desarrollar una infección invasora por hongos. Además, estudios realizados en los últimos años muestran que el fondo genético del hospedador está asociado con la predisposición al desarrollo de este tipo de enfermedades. En concreto se han identificado polimorfismos genéticos de nucleótido simple (“Single Nucleotide Polymorphism”- SNP) en genes que codifican para componentes celulares que interaccionan con estructuras  fúngicas y/o que están involucradas en la respuesta inmune del huésped frente a agentes infecciosos como Aspergillus. En este sentido se han estandarizado y aplicado herramientas para la detección de SNPs en humanos de genes diana asociados concretamente con la susceptibilidad a la Aspergilosis Invasora.

Estudio de los mecanismos de virulencia en Aspergillus fumigatus

En paralelo al estudio de la respuesta del hospedador se sigue una línea cuyo objetivo es caracterizar mecanismos de virulencia en A. fumigatus. Uno de los principales mecanismos por los que A. fumigatus es capaz de causar enfermedad en humanos es su capacidad de adaptarse a las condiciones ambientales del hospedador. Entre las moléculas y los genes que se han relacionado con la virulencia de este hongo se encuentran componentes de la pared celular, genes y moléculas relacionadas con la evasión de la respuesta inmune, sistemas de detoxificación de los compuestos derivados del oxígeno, la producción de toxinas, la obtención de nutrientes como hierro, fósforo, nitrógeno y la adaptación a pH y temperatura del hospedador.  Estos estudios permiten profundizar en el conocimiento sobre la patogenicidad de este hongo e identificar nuevas dianas terapéuticas

Nuevos antifúngicos y aspergilosis crónicas.

Epidemiología, resistencia y actividad de nuevos antifúngicos

El conocimiento de la epidemiología y la tasa de resistencia a los antifúngicos es esencial para un manejo adecuado de los pacientes y una estrategia de detección y diagnostico apropiada. La resistencia a los antimicrobianos es hoy una de las mayores amenazas para la salud mundial siendo el desarrollo y comercialización de nuevos compuestos una de las prioridades del sector de la salud. Se han realizado en colaboración con centros del Sistema Nacional de Salud varios estudios poblacionales, con el fin de conocer la epidemiología de los hongos filamentosos en España y la tasa de resistencia a los antifúngicos. Se ha encontrado que más de un 10% de las infecciones por hongos filamentosos están producidas por especies crípticas que suelen ser más resistentes a los antifúngicos. En los últimos años han aparecido varios compuestos con capacidad antifúngica que están en diferentes fases de desarrollo, en nuestro grupo se ensayan estos nuevos compuestos frente a los principales géneros de especies patógenas, incluyendo las especies crípticas multiresistentes. 

Aspergilosis Pulmonar Crónica y Aspergilosis Broncopulmonar alérgica

Estas enfermedades ocurren generalmente en personas inmunocompetentes. La incidencia de estas enfermedades es prácticamente desconocida. La ausencia de un diagnóstico apropiado y del tratamiento óptimo complica el manejo de estos pacientes. Varios estudios han documentado la presencia de cepas multiresistentes en estos pacientes, debido a tratamiento prolongados. En esta línea se está trabajando en mejorar el algoritmo diagnóstico de estas enfermedades, así como analizar la epidemiología de las especies aisladas en estas infecciones y la influencia de cambios en el micobioma pulmonar y ambiental.
 

Enfermedades fúngicas y Salud global

Muchos países de renta media y baja se encuentran en zonas de alta incidencia de hongos, sin embargo, tienen menos herramientas y capacidad diagnóstica para manejarlas. Con el fin de conocer la incidencia de las infecciones oportunistas por hongos y disminuir la muerte asociada a las mismas en pacientes que viven con VIH en Guatemala y en colaboración con el Fondo de acción Global para las infecciones fúngicas (GAFFI), se ha desarrollado una red de unidades de atención integral al sida e implementado un laboratorio central de diagnóstico, que hace de referencia para el diagnóstico en varias infecciones oportunistas. Se ha hecho un estudio de cohortes incluyendo a más de 2500 pacientes HIV+ con un seguimiento de un año. Se han tamizado las principales infecciones fúngicas en este grupo de pacientes permitiendo el acceso al diagnóstico y al tratamiento de las mismas en la mayor parte del país y consiguiendo una disminución de mortalidad en un año del 7%.

Mechanisms of pathogenic fungal host adaptation: Morphogenesis in Cryptococcus neoformans

One of the main mechanisms by which fungi are able to cause disease in humans is their ability to evade the immune response and adapt to the environmental conditions found in the host. In this regard, one of the yeasts that has the greatest ability to adapt to the host is Cryptococcus neoformans. This fungus is found in the environment, and is acquired by inhalation, although the most typical picture is meningitis in immunocompromised patients, mainly HIV+. The main phenotypic characteristic is the presence of a polysaccharide capsule surrounding the cell, which is considered a virulence factor. In addition, C. neoformans is able to increase cell size significantly forming “titan” cells, which can reach a diameter of more than 70 microns. In the laboratory, we are interested in the role of these titan cells in the virulence of C. neoformans. Recently, we have described in vitro media in which C. neoformans forms pseudo-titan cells, which has allowed us to identify new factors and pathways involved in this process.

Mechanisms of action of antifungals

In parallel, we have a line whose main objective is to characterize the mechanisms of action of antifungals. Specifically, we have focused our work on the effect of Amphotericin B (AmB). For decades it has been thought that this antifungal causes cell death after binding to ergosterol and pore formation. Our results indicate that this antifungal also induces strong oxidative stress in the cell, which occurs before cell integrity is lost. Furthermore, we have shown that oxidative stress is necessary for the fungicidal action of AmB. These results open the door to design new strategies to improve its efficiency in patients.

New therapeutic strategies

Work with AmB has led to research aimed at improving antifungal therapies. In particular, we have used the strategy of “off-patent” drug repositioning to search for new activities. Using this approach, we have identified several drugs that increase the effectiveness of AmB against major pathogenic yeasts, such as the antibiotic erythromycin. This approach has allowed us to identify drugs with antifungal activity against emerging pathogens, such as Candida auris.

​El diagnóstico de la infección fúngica invasora (IFI) es complicado y con frecuencia se retrasa ya que en muchas ocasiones a la falta de sospecha clínica se le suma la falta de herramientas diagnósticas eficaces. Esta línea de investigación se inició en el año 2003, primero liderada por el Dr. Manuel Cuenca-Estrella y posteriormente por la Dra. María José Buitrago con el objetivo general de desarrollar nuevas herramientas, basadas en la PCR en tiempo Real, para un diagnóstico rápido de IFI. Los objetivos concretos que se han ido alcanzando a lo largo de estos años han sido los siguientes:

Detección precoz de hongos causantes de infecciones fúngicas oportunistas más frecuentes en pacientes inmunodeprimidos (Aspergilosis y Candidiasis invasoras)

Se han desarrollado y validado técnicas de PCR en tiempo Real en formato multiplex para el cribado de pacientes en riesgo de padecer estas infecciones, así como para el diagnóstico en pacientes con sospecha.

Detección de IFIs causadas por hongos emergentes (Escedosporiosis, Fusariosis etc...)

El aumento de especies raras o poco frecuentes causantes de IFI hizo necesario el desarrollo de técnicas para su detección

Detección “panfúngica”

Para aquellos casos en los que no exista evidencia clara del hongo causante de la infección se han desarrollado técnicas basadas en PCR en tiempo Real.   

Mejora del diagnóstico y la identificación de los hongos causantes de micosis importadas (micosis endémicas)

Debido al aumento de la inmigración y los viajes a lugares exóticos en los últimos años se ha producido un incremento de las micosis importadas en España, en concreto de aquellas causadas por hongos endémicos de determinadas regiones, los cuales son además patógenos primarios. Este objetivo es relevante en el contexto de una región no-endémica ya que existe falta de experiencia en el manejo de estas infecciones y las técnicas diagnósticas disponibles son muy escasas. A lo largo de estos años se han desarrollado y validado distintas técnicas para el diagnóstico rápido de estas micosis y se han realizado diferentes trabajos encaminados a un mejor conocimiento de los hongos que las causan.

Las técnicas desarrolladas a lo largo de estos años se han incorporado a la Cartera de Servicios del Centro Nacional de Microbiología para ofrecerlas al Sistema Nacional de Salud. Además, algunas de ellas se han patentado.